جداسازي مولکولهاي نشاندار متصل و آزاد:

اگر به روش اجرايي آزمون هاي سنجش ايمني دقت شود، مستقل از نوع ترکيب نشاندار (آنزيم، راديواکتيو، فلورسان و ...) و نوع روش (معرف مازاد- معرف محدود) به کليه موارد اعم از استانداردها، کنترل و نمونه هاي مجهول ميزان برابري از ترکيب نشاندار افزوده مي شود و چون ميزان عامل سيگنال دهنده برابر است سيگنال ايجاد شده نيز برابر خواهد بود. به عبارتي در کليه غلظتها، سيگنال يکساني دريافت شده، لذا اندازه گيري تحت هيچ عنوان صورت نخواهد پذيرفت. در واقع، ميزان کمپلکس ايمني تشکيل شده با غلظت آناليت مورد سنجش رابطه دارد اما ميزان تام عامل سيگنال دهنده در همه جا برابر است لذا يک مرحله اساسي در روش هاي سنجش ايمني مورد نياز است و آن جداسازي کمپلکس هاي نشاندار از مولکولهاي نشاندار آزاد مي باشد. اينگونه سنجش ها که نياز به مرحل? جداسازي دارند را سنجش هاي ايمني غير يکنواخت، غير همگون و يا ناهمگون (separation Step) گويند. چنانچه با هر روشي بتوانيم ميان مولکول نشاندار موجود در کمپلکس تفاوت سيگنال ايجاد نماييم، ديگر نيازي به مرحل? جداسازي نخواهد بود. به روش هاي سنجش ايمني که فاقد مرحله جداسازي هستند، سنجش هاي يکنواخت و يا همگون (Heterogenious assay) مي گويند.
در سنجش هاي ناهمگون از روش هاي متعددي براي جداسازي عامل سيگنال دهنده آزاد از متصل استفاده مي کنند. در اغلب موارد به دليل سرعت عمل و سادگي از روش هاي جداسازي غير ويژه استفاده مي شود؛ مانند استفاده از:
1) ذغال فعال؛ 2) سيليکات ها؛ 3) پلي اتيلن گليکول؛ 4) رسوب دهي با نمک
در مورد ذغال فعال و سيليکات ها بايد دقت نمود زيرا اين ترکيبات پس از جمع آوري آناليت نشاندار آزاد، شروع به جدا کردن و جذب آناليت هاي متصل به آنتي بادي مي کنند لذا ميزان و زمان استفاده از ترکيبات فوق بايد کنترل شود. استفاده از الکل ها، نمک و يا مولکولهاي بزرگ مانند پلي اتيلن گليکول با جرم مولکولي 4000 تا 8000 دالتون سريعتر از رسوب دهي با الکل يا نمک است اما واکنش دو مورد آخري کامل تر مي باشد. در برخي از سنجش هاي ناهمگون براي جداسازي از آنتي بادي ثانويه (Second Antibody) استفاده مي کنند. اين روش ويژه تر از ساير روش ها است اما به زمان بيشتري نياز دارد لذا براي تقويت، از آنتي بادي هاي ثانويه به همراه ساير روش هاي توضيح داده شده استفاده مي شود.
يکي از رايج ترين و کارآمد ترين روش هاي مرحله جداسازي در سنجش هاي ناهمگون استفاده از فاز جامد يا تثبيت يکي از اجزاء کمپلکس مي باشد. با تثبيت آنتي ژن يا آنتي بادي، کمپلکس به فاز جامد متصل مي ماند، لذا با شستشوي ساده مولکول سيگنال دهنده آزاد از محيط خارج مي شود. تا کنون از فازهاي جامد متعددي استفاده شده است:
1) دانه هاي (Beads) پلي استيرن؛ 
2) لوله هاي پلي استيرني يا چاهکهاي (Wells) مربوطه؛ 
3) سلولز؛ 
4) نايلون؛ 
5) ذرات مغناطيسي
روش هاي فوق بسيار ساده و عملي مي باشند اما جذب غير اختصاصي مولکول نشاندار يکي از مشکلات اصلي مي باشد که خوشبختانه با استفاده از محلول هاي شستشو گر حاوي املاح و دترژان اين شکل نيز تا حدود زيادي بر طرف شده و در مواردي تثبيت آنتي بادي با کاهش فعاليت آن همراه است. اين موضوع کاربرد اين روش را کمي محدود مي سازد.

 

صفحه قبل

صفحه بعد